黃曲霉毒素B1 （Ⅰ型）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

黃曲霉毒素是曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉的二次代謝產(chǎn)物，是自然界最危險的致癌物質(zhì)之一，廣泛存在于谷物、堅果、棉籽以及以此為原料生產(chǎn)的各種食品、油料、酒類、飼料中，并能通過動物體產(chǎn)生同樣有害的代謝產(chǎn)物，存在于牛奶及奶制品，肉類甚至人體血液，組織中。

黃曲霉毒素中毒性最強的是黃曲霉毒素B1，是世界衛(wèi)生組織規(guī)定的I類致癌物質(zhì)，毒性是砒霜的68倍，其幾乎一直和黃曲霉毒素B2、G1 和 G2共存，是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分國家和地區(qū)都已對食品和飼料中的黃曲霉毒素最高允許水平作了規(guī)定，因此，準(zhǔn)確測定食品及飼料中的黃曲霉毒素含量對于食品安全監(jiān)控具有重要意義。

【適用范圍】

可定性、定量檢測玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲霉毒素B1。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA原理，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素B1抗原，加入樣本/黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素B1與預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素B1抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素B1的含量成負(fù)相關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素B1的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：0.1ppb

【交叉反應(yīng)率】

   結(jié)構(gòu)類似物                                                                  交叉反應(yīng)率

  黃曲霉毒素B1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲霉毒素B2   ……………………………………………………………   15%

  黃曲霉毒素G1   ……………………………………………………………   11%

  黃曲霉毒素G2   ……………………………………………………………    4%

  黃曲霉毒素M1  ……………………………………………………………  0.5%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）

    0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

3. 酶標(biāo)物1瓶  ……………………………………………  6ml

4. 顯色液1瓶  …………………………………………… 12ml

5. 終止液1瓶  …………………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶  …………………………50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 …………………… 50ml

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅氮吹儀

┅┅粉碎機

┅┅離心機

┅┅天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道移液器300μl

試劑：

┅┅甲醇（分析純）

┅┅石油醚

┅┅去離子水（或蒸餾水）

┅┅三氯甲烷

┅┅NaCl

【試劑配制】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。

3. 谷物稀釋液：將0.9gNaCl用配制完成的樣品稀釋液溶解并定容至100ml。

4. 啤酒稀釋液：取甲醇，用配制完成的樣品稀釋液按1:4體積比進行稀釋（1份甲醇+4份樣品稀釋液）。

5. 50%甲醇：取甲醇，用去離子水按1:1體積比進行稀釋（1份無水甲醇+1份去離子水）。

6. 80%甲醇：取甲醇，用去離子水按4:1體積比進行稀釋（4份無水甲醇+1份去離子水）。

【樣本前處理步驟】

一、 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）（稀釋倍數(shù)：8）

1. 取1.0g粉碎的樣品與8ml 谷物稀釋液混合均勻；

2. 強力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取上清液100μl待測 。

二、 蛋糕（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4ml 50%甲醇混合均勻；

2. 強力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測 。

三、 花生、奶油蛋糕（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合均勻；

3. 強力振蕩3min；

4. 5000g離心10min；

5. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

6. 取100μl稀釋后液體待測 。

四、 食用油（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合，振蕩1min；

3. 靜置10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測 。

五、 飼料、面粉、湯圓（稀釋倍數(shù)：24）

1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲醇混合均勻；

2. 強力振蕩3min；

3. 2000g離心10min；

4. 取上層清液100μl，加入700μl樣品稀釋液，混合均勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測。

六、 啤酒（稀釋倍數(shù)：5）

1. 取200μl啤酒樣品（去除CO2），加入800μl啤酒稀釋液；

2. 振蕩3min；

3. 取100μl稀釋后液體待測。

七、醬油、醋、葡萄酒（稀釋倍數(shù)：8）

1. 取0.5ml樣品，加入0.5ml蒸餾水并加入4.0ml三氯甲烷；

2. 混勻振蕩3min，5000g離心10min；

3. 取1.0ml下層液，60℃氮氣吹干；

4. 加入100μl乙腈溶解干燥物，并加入900μl樣品稀釋液，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。

3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。

【結(jié)果判定】

1. 百分吸光率的計算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/ B0×100%

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實際含量。

【注意事項】

1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應(yīng)終止液為0.5M的硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑變質(zhì)的跡象：

顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8. 加入顯色液后，一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應(yīng)時間。

9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【樣品最低檢測限】

    谷物 …………………………………………………0.8ppb

    蛋糕 ……………………………………………………1ppb

    花生、奶油蛋糕 ……………………………………1ppb

    食用油 …………………………………………………1ppb

    飼料、面粉、湯圓 ………………………………2.4ppb

    啤酒 …………………………………………………0.5ppb

    醬油、醋……………………………………………0.8ppb

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。